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PCR法DNA探针地高辛标记试剂盒图片
产品货号:
BTN90604C
中文名称:
PCR法DNA探针地高辛标记试剂盒
英文名称:
PCR DNA Labeling Kit(Digoxin)
产品规格:
5T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本试剂盒提供了一站式PCR法DNA探针标记用的经过优化的试剂,不需要用户自己摸索标记条件。所得的地高辛标记DNA探针可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落杂交和斑点印迹杂交等分析。




用PCR对DNA进行地高辛标记的原理是用带地高辛标记的dNTP进行PCR,这些dNTP掺入到PCR产物中之后,扩增得到的DNA片段自然就带有地高辛标记,可以直接用于杂交试验。




  • 优化的地高辛掺入率,能有效降低探针中地高辛分子之间的可能空间阻碍,检测效果佳。
  • 既可用于制备双链DNA探针,也可以用于单链DNA探针。
  • 一次标记反应可以得到ug级的地高辛标记双链DNA探针或约700ng地高辛标记的单链DNA探针,足够多次杂交实验用。



组分规格
标记专用PCR Mix(含酶)60μL
dNTP Mix,2.5mM each25μL
含DIG-11-dUTP的dNTP,2.5mM25μL
超纯水1mL

保存:-20℃,有效期1年。


DNA模板和模板专一性引物,常规PCR Mix。


  • 准备工作
    1. 按常规的方法设计PCR引物,使PCR产物(探针)长度在400~800bp之间。过短则地高辛标记掺入少,探针杂交信号强度减弱;过长则非特异杂交增加,背景变强。
    2. 为保证成功率,最好先用常规PCR产物制备DNA片段,再以之为模板进行标记PCR反应。不推荐以基因组DNA或其他背景复杂的DNA为模板直接进行PCR标记反应。
  • 用常规PCR制备模板
    1. 用自备的PCR试剂盒按下表设置50μL的常规PCR反应以制备标记PCR模板:
      成分用量
      自备的2×PCR Mix(含酶、dNTP)25μL
      引物一和引物二(10pmol/μL)各5μL
      1μg基因组DNA或1ng质粒DNA1μL
      超纯水至50μL
    2. 按引物Tm值设计的PCR参数进行常规PCR。
    3. 用自备胶回收试剂盒回收常规PCR产物并定量。胶回收步骤可以去残留引物,避免对后续的标记PCR反应的干扰。
  • 标记PCR反应
    成分标记PCR常规PCR
    标记专用PCR Mix(含酶)6μL6μL
    含DIG-11-dUTP的dNTP,2.5mM5μL不加
    dNTP Mix,2.5mM不加5μL
    若双链标记,加引物一和引物二;
    若单链标记,只加一条引物
    各50pmol各50pmol
    胶纯化所得PCR产物10ng(对双链标记)
    100ng(对单链标记)
    10ng(对双链标记)
    100ng(对单链标记)
    超纯水至50μL至50μL
    • 由于双链PCR探针在杂交时变性的双链彼此还会复性,降低杂交效率,因此强烈推荐使用单链标记PCR。在设置标记PCR时必须做一个常规PCR对照(本试剂盒足够5次标记PCR和5次常规PCR对照)。
    1. 由于此步所用的PCR引物和第3步的PCR引物完全一样,故可以参考第3步PCR参数进行标记PCR,但需要进行下列修改:一是循环数增加到35~55个循环,使扩增得到的探针DNA片段参差不齐,杂交时这种DNA能形成网络结构,杂交效果比长度整齐的DNA更好;二是延伸步骤的时间增加15秒,因为标记dUTP掺入到DNA的速度比常规的dTTP慢,增加延伸步骤的时间可以保证更多的标记dUTP掺入到合成的DNA探针中;三是降低复性温度5~7℃,因为标记核苷酸参入到DNA后,含标记核苷酸的DNA的Tm值将比正常的DNA降低。
    2. PCR结束后,取标记PCR反应液和对照反应液3~5μL进行琼脂糖凝胶电泳(一定要使用浓度已知的DNA marker),检测标记是否成功。由于标记DNA含有额外的标记物、分子量更大,其泳动速度将慢于常规PCR产物。下图是一个典型的双链标记PCR产物和常规PCR产物电泳速度差异的比较图:
      PCR法DNA探针地高辛标记试剂盒
      图1.标记的DNA(右)与未标记的DNA(左)电泳比较
    3. 探针的定量:电泳所用的DNA marker浓度已知(如果不确定,可以问供应商),上样体积已知,故上样量已知,就可通过双链探针DNA和DNA marker对应条带的相对亮度来估计探针DNA浓度。例如,如果探针长度为500bp,而marker中500bp这条带的浓度是10ng/μL,共上样10μL,则500bp这条带的上样量为100ng。标记的探针DNA在紫外下亮度只有它的一半,则探针DNA的上样量为100/2=50ng,如果上样量是5μL,则探针的浓度是50/5=10ng/μL。但是,如果制备的是单链DNA探针,则不能按此法估计浓度,因为单链DNA结合核酸染料(如EB和SYBR Green I)的能力远低于双链DNA。但可以采用银染法定量(跟marker比较)。一般100ng模板经单链标记PCR扩增可得到700ng左右单链探针。
    4. 单链PCR标记产物可以不经过纯化直接加入到杂交液中,双链PCR标记产物需要加热到95~100℃ 5分钟变性然后放冰上急冷后再加入到杂交液中使用。
    5. 如果不立即使用,需要放-20℃长期保存,不能放常温保存,否则Taq DNA酶有残留的外切酶活性,探针DNA可能会被降解。如果需要纯化,请使用乙酸铵/乙醇沉淀法纯化(参考分子克隆手册)。

相关搜索:PCR法DNA探针地高辛标记试剂盒DNA探针标记地高辛标记DNAPCR法PCR DNA Labeling Kit(Digoxin)
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